众所周知，缺氧能促进肿瘤发生发展，由于扩散受限和血管系统效率低下，90%的实体肿瘤发生缺氧。在诊断时，缺氧已被认为是患者预后的不利指标，与临床分期无关。而转移扩散，是许多晚期癌症的表现之一，患者的癌细胞的附着能力下降甚至完全丧失，迁移能力增强，导致癌细胞从原生部位随血液或淋巴系统转移到其他身体部位，形成新的肿瘤。本文提出了一种在体内对缺氧细胞定位监测的方法，以确定它们对生理氧梯度的细胞反应，并量化它们对肿瘤转移性扩散发挥的作用。本研究发现在体内经历肿瘤内缺氧的细胞与在体外暴露于缺氧的细胞有不同的基因表达模式。瘤内缺氧基因特征是判断远处无转移生存期的更好预后指标。缺氧后肿瘤细胞具有抗ROS表型，在血液中有生存优势，并促进其建立显性转移的能力。缺氧后的细胞在转移部位保留了一组缺氧诱导基因的表达增加，提示了“缺氧记忆”的可能性。
图1生理性氧梯度下的肿瘤细胞状态。缺氧细胞(棕色)与坏死细胞(紫色)和充氧细胞(粉红色)相邻，呈空间分布。
此前，体内低氧组织的测量分直接和间接两种，直接测量主要有氧电极法和光纤探针法；间接测量主要通过免疫组化和低氧探针（如pimonidazole），但这些方法均不能追踪经历低氧的乳腺癌细胞在血液中再氧化和肺部远端转移的过程。
因此，本文建立了一个细胞体系，当细胞缺氧时，通过触发荧光开关从DsRed到GFP，能永久标记细胞。通过慢病毒的方法建立一个双载体系统，载体1包含一个被氧依赖降解域(ODD)修饰的Cre基因，通过人工合成的HIF-DNA结合序列(HRE)转录控制ODD。载体2表达了一个带有终止密码子的红色荧光报告蛋白(DsRed)，两侧排布串联loxP位点，接着是一个编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。在缺氧条件下，HIF稳定导致基因修饰的Cre的转录激活，导致DsRed基因的剪切，使GFP永久表达。红色荧光向绿色荧光不可逆改变限制在氧浓度低于0.5%的情况下发生。
图2慢病毒的结构及作用机理
同时作者建立了一种转基因小鼠模型，当细胞经历缺氧时，其细胞永久性地从tdTomato转换为GFP。首先根据慢病毒载体1建立对氧浓度依赖的单转基因小鼠1，根据慢病毒载体2建立的含Cre-报告基因的单转基因小鼠2，杂交成双转基因小鼠，使其与可以自发生成乳腺癌的单转基因小鼠3杂交，得到三转基因小鼠模型。
图3三转基因小鼠的建立方法
在体外模型和体内模型验证后，作者比较了体内和体外低氧暴露下的基因表达变化。首先将小鼠体内的乳腺癌肿瘤组织中的GFP+和DsRed+肿瘤细胞分离出来，进行转录组测序，其中有个差异基因上调，49个差异基因下调。随后将体外高浓度氧（20%）培养24h的肿瘤细胞和低氧（1%）培养24h的肿瘤细胞做转录组测序，与体内肿瘤细胞测序结果相比，其中有41个共同的基因上调，3个共同基因下调，但是近个基因在体外缺氧时上调，而在体内则没有，即经历低氧的体内肿瘤细胞和体外肿瘤细胞转录图谱有差异，对体外缺氧培养条件(24小时)的反应并不能概括肿瘤内缺氧生理水平的反应。同时，实验发现即使在标准组织培养后，肿瘤内缺氧诱导的基因表达也不是完全可逆的，而体外缺氧作用在20%O2下培养2天内逆转。
图4瘤内缺氧细胞转录组差异表达图谱
对位患者的转录组数据进行分析，研究3组差异基因即瘤内差异表达基因、共差异表达基因、体外肿瘤细胞差异表达基因对患者预后的影响，结果发现41个共差异表达基因对患者的预后预测较准确。
为研究瘤内缺氧对肿瘤转移的影响，从荷瘤小鼠体内切除肿瘤，检查切除时小鼠血液和肺部GFP+和DsRed+的细胞。研究结果表明：(1)肿瘤周围坏死区附近的部分缺氧细胞可以克服氧气缺乏状态，并发生转移；(2)离开原发肿瘤缺氧区、进入血流的细胞将暴露于更高的氧气水平中(再氧化)；(3)原发肿瘤在血液中、肺中细胞呈GFP+，即缺氧状态；(4)缺氧后细胞在血液和肺中被发现的几率要高4~5倍。同时，实验证明DsRed+向GFP+转化并不会发生在血液运输过程中，以及远端转移之后。
图5瘤内缺氧后的细胞转移能力增强
以上结果表明，瘤内缺氧的细胞在远端转移过程的前期有很强的局部侵袭和在血液中存活的潜能。
为了比较GFP+和DsRed+细胞的侵袭潜能，从原发肿瘤中分离出癌细胞，并将其与90%未标记的MDA-MB-细胞结合，生成球状体来跟踪细胞迁移并拟合细胞轨迹，GFP+细胞在总扩散率和持续时间上有显著的增加、预测的细胞轨迹更长。肿瘤球周围有明显的GFP+细胞突出，这可能也能证明低氧后的肿瘤细胞的侵袭能力显著增强。
图6瘤内缺氧后的细胞侵袭能力增强
为探索GFP+细胞是否有更强的抵抗氧化应激的能力，作者直接评价线粒体ROS水平，分离了小鼠原发肿瘤和血液中的GFP+和DsRed+癌细胞，并对其进行MitoROS染色。原发肿瘤和血液中，DsRed+细胞中的ROS水平均显著高于GFP+细胞。与原发肿瘤相比，DsRed+细胞在血液中的ROS水平增加了2倍，而GFP+细胞在肿瘤和血液中都保持了相同的ROS水平。通过使用ROS抑制剂n-乙酰半胱氨酸(NAC)处理即时分离的CTCs,DsRed+CTCs中的ROS水平降低到GFP+细胞中的ROS水平。ROS水平的增加与从血液中DsRed+CTCs的活力降低相关。为了证实这种耐受表型，直接用H2O2处理原发肿瘤来源的GFP+或DsRed+细胞1小时，以促进ROS诱导的凋亡，并在48小时后评估细胞存活率。GFP+细胞对H2O2(50~μM)的耐受性明显高于DsRed+细胞。研究结果表明，GFP+细胞比DsRed+细胞更能抵抗氧化应激，并在血液中能维持较低水平线粒体ROS，同时DsRed+细胞也更容易受到ROS诱导的凋亡。
另外，为了确定ROS耐受表型是否能增强GFP+细胞完成晚期转移外渗和定植的能力，原发肿瘤中分离出的等量的GFP+和DsRed+细胞被注射到小鼠的尾静脉。DsRed+和GFP+细胞在注射后48小时于肺部静脉发现，且数量基本相同。尾静脉注射25天后GFP+的结节数量是DsRed+的两倍。
图7GFP+细胞有更强的抵抗氧化应激的能力
为了确定ROS耐受表型是否会在成功定植肺部的细胞中持续存在，转录组测序结果表明与转移的DsRed+细胞相比，GFP+细胞中个基因上调，47个基因下调，转移的DsRed+细胞中ROS通路不再富集。对比原位肿瘤细胞的转录组测序结果，发现原位肿瘤和肺转移的GFP+细胞与DsRed+细胞相比，共有19个表达上调的基因，19个基因中有9个以HIF依赖的方式受低氧调控。数据显示原发肿瘤缺氧诱导的一组基因在转移部位仍然过表达。这种缺氧记忆是否以及如何发生尚不清楚，但推测这些基因可以作为生物标记物来识别肿瘤内缺氧的转移部位的细胞。
图8GFP+细胞在转移灶表示出“记忆性”
参考文献：